骨骼肌組織工程旨在替換或恢復(fù)因疾病、事故或嚴(yán)重手術(shù)而受損或喪失部分功能的骨骼肌，通過培養(yǎng)從患者體內(nèi)獲得的肌源性祖細(xì)胞或干細(xì)胞，直接培養(yǎng)或搭載支架上來制備出可以植入患者體內(nèi)的功能性骨骼肌。骨骼肌組織工程在再生醫(yī)學(xué)以及基于細(xì)胞分析的生物機(jī)器人、生物傳感、能量收集和藥物篩選方面都有廣泛地應(yīng)用。但如何利用現(xiàn)有的組織工程制造方法來重現(xiàn)肌肉的復(fù)雜性仍然是一個(gè)挑戰(zhàn)。

來自美國(guó)加州大學(xué)的Ali Khademhosseini教授團(tuán)隊(duì)在Small雜志上發(fā)表了題目為“3D Bioprinting in Skeletal Muscle Tissue Engineering ”的綜述文章，簡(jiǎn)述了骨骼肌的解剖結(jié)構(gòu)并從打印工藝、墨水配方及性能、生物3D打印技術(shù)在表面貼裝技術(shù)方面取得的進(jìn)展等角度概述了生物3D打印技術(shù)在骨骼肌組織工程中的應(yīng)用。

人體共有600多塊不同的骨骼肌，約占全身重量的45%，共同參與骨骼支持，維持各類運(yùn)動(dòng)的穩(wěn)定性和協(xié)調(diào)性，以及新陳代謝的調(diào)節(jié)。骨骼肌解剖學(xué)結(jié)構(gòu)如圖1所示，骨骼肌是由具有收縮能力的肌細(xì)胞或肌纖維所組成，薄層結(jié)締組織包裹的肌肉纖維軸向排列形成一束，外側(cè)由結(jié)締組織所覆蓋和接合在一起。骨骼肌還與接收營(yíng)養(yǎng)和清除廢物的血管網(wǎng)相連，與激活和收縮的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)相連，并通過肌腱與骨骼相連。

圖1 骨骼肌解剖學(xué)結(jié)構(gòu)

研究現(xiàn)狀

為了改善骨骼肌細(xì)胞分化并獲得具有高功能性的肌肉組織，目前已經(jīng)開發(fā)了具有特定形貌特征、硬度、導(dǎo)電性、聚合物成分和可溶性因子的支架。此外，通過使用骨骼肌細(xì)胞與成纖維細(xì)胞的共培養(yǎng)物來工程化肌腱連接，或與內(nèi)皮細(xì)胞共培養(yǎng)來獲得血管化肌肉。為了進(jìn)一步改善工程肌肉的功能，研究人員致力于模擬體內(nèi)骨骼肌的結(jié)構(gòu)和微環(huán)境。所有傳統(tǒng)方法的一個(gè)共同點(diǎn)是制造各向異性支架，以允許肌肉細(xì)胞排列和促進(jìn)肌肉生成。然而，這些方法在誘導(dǎo)精確的3D空間細(xì)胞組織方面有局限性。如圖2所示，3D 生物打印技術(shù)旨在通過在細(xì)胞和基質(zhì)沉積中提供高精度來克服這些限制，從而快速制造復(fù)雜結(jié)構(gòu)或與神經(jīng)細(xì)胞一起獲得神經(jīng)肌肉連接，來制造更復(fù)雜的工程化組織。

圖2 常規(guī)方法和生物3D打印方法所制備的骨骼肌組織。a. 3D打印肌腱鏈接。b.利用靜電紡絲工藝進(jìn)行肌腱剛度調(diào)節(jié)。c.設(shè)計(jì)芯片控制神經(jīng)與肌肉的連接。d.在3D打印的水凝膠結(jié)構(gòu)上共培養(yǎng)肌肉和運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元。

 生物3D打印沉積策略

生物3D打印是指可用于制造包含細(xì)胞和材料的3D物理結(jié)構(gòu)的技術(shù)。如圖3所示，常用技術(shù)包括擠出打印、噴墨打印、激光輔助打印和立體平面打印。噴墨打印基于一滴一滴的生物墨水沉積，并使用不同的操作機(jī)制，如熱、壓電、靜電、聲學(xué)、流體動(dòng)力學(xué)和微型閥來產(chǎn)生生物墨水液滴。擠出打印依賴于使用氣動(dòng)或機(jī)械壓力推動(dòng)生物墨水通過噴嘴。生物墨水沉積，通過在平臺(tái)上沿X-Y方向光柵掃描打印頭而發(fā)生，打印頭或載物臺(tái)沿 Z 方向移動(dòng)，允許逐層放置。在激光輔助打印中，玻璃或石英帶被一薄層金屬覆蓋，然后裝載生物墨水。激光脈沖誘導(dǎo)金屬膜蒸發(fā)，形成高壓氣泡，將生物墨水液滴推向基底。在立體平面打印中，激光以逐點(diǎn)方式固化光敏樹脂，形成 3D 結(jié)構(gòu)?；谕队笆焦夤袒?D打印(DLP)使用數(shù)字微鏡陣列器件，該器件由數(shù)百萬個(gè)可單獨(dú)尋址的微鏡組成，這些微鏡可以打開或關(guān)閉，以逐層的方式固化目標(biāo)投影3D結(jié)構(gòu)的整個(gè)平面。DLP為使用微米分辨率打印3D結(jié)構(gòu)提供了卓越的速度、分辨率、可擴(kuò)展性和靈活性。

圖3 三種主要的生物3D打印策略

生物墨水配方

天然和合成的聚合物已被廣泛應(yīng)用于生物3D打印骨骼肌的墨水配方。在天然聚合物中，快速交聯(lián)水凝膠如藻酸鈣或纖維蛋白已經(jīng)直接用作生物墨水或在打印過程中用作支撐材料，以保持不太穩(wěn)定的生物材料的可打印性。其他天然水凝膠，如藻酸鹽、膠原和明膠，已被廣泛用于為工程化組織提供物理支持和細(xì)胞支持功能。此外，通過負(fù)載富含自體生長(zhǎng)因子的血小板血漿的藻酸鹽生物來制備組織工程支架可增強(qiáng)血管生成、減少炎癥、干細(xì)胞募集以及心血管和骨骼肌組織再生。如圖4所示，近15年來，為了精確調(diào)節(jié)天然聚合物的機(jī)械性能，研究人員已經(jīng)開發(fā)出各種化學(xué)官能團(tuán)如甲基丙烯?；c天然聚合物共軛，使它們可通過自由基聚合發(fā)生光交聯(lián)。GelMA、HAMA、PEGDA、SilMA、AlgMA、DexMA、CSMA等可快速光交聯(lián)的水凝膠材料通過各種混合配方可獲得優(yōu)異的生物學(xué)性能，可以打印出具有不同形狀、濃度和機(jī)械性能的載細(xì)胞水凝膠構(gòu)建體。此外，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)向細(xì)胞的傳遞是大尺度組織制造和維持中的關(guān)鍵問題，目前研究人員已經(jīng)做了大量工作來促進(jìn)肌肉組織中的血管化網(wǎng)絡(luò)。例如，使用同軸噴嘴來制造中空結(jié)構(gòu)，通過在復(fù)合 GeLMA(3.5-5%)-藻酸鹽(4%)生物墨水打印內(nèi)皮細(xì)胞和新生心肌細(xì)胞而獲得血管化的心臟組織。此外，包括肝、心臟、軟骨、皮膚、脈管系統(tǒng)、腦、肺、腎、骨、脊髓、結(jié)腸、臍帶、胰腺、脂肪組織和骨骼肌來源的dECM的生物墨水也被廣泛應(yīng)用于構(gòu)建功能化復(fù)合生物墨水。

圖4 近15年來已發(fā)表的論文中，生物3D打印骨骼肌所用材料的百分比

生物3D打印在骨骼肌組織工程中的應(yīng)用

生物3D打印能夠?qū)崿F(xiàn)細(xì)胞的精確定位和排列。例如，將小鼠成肌細(xì)胞(C2C12)精確地分布在懸浮的水凝膠基質(zhì)中并可功能化形成具有生理反應(yīng)的肌管。如圖5a所示，Bashir 和他的同事通過3D打印技術(shù)制造了一種生物裝置，由兩個(gè)不同長(zhǎng)度的剛性柱子通過柔性梁連接而成。溶液中的 C2C12、細(xì)胞外基質(zhì)蛋白和基質(zhì)凝膠被澆鑄在柱子周圍和柱子之間并凝膠化剝離，凝膠的壓實(shí)和兩個(gè)支柱之間誘導(dǎo)的張力有利于肌管的成熟，在電脈沖刺激下肌管可發(fā)生收縮使該結(jié)構(gòu)進(jìn)行類似尺蠖的爬行運(yùn)動(dòng)。如圖5b所示，由一對(duì)對(duì)抗的骨骼肌組織驅(qū)動(dòng)的生物混合機(jī)器人是由3D打印的樹脂骨架組成，承載用于主動(dòng)刺激負(fù)載成肌細(xì)胞的水凝膠片的電極，該水凝膠片安裝在骨骼的兩側(cè)以充當(dāng)拮抗肌。該生物混合機(jī)器人能夠進(jìn)行關(guān)節(jié)旋轉(zhuǎn)角度接近 90°的移動(dòng)，可以用來執(zhí)行簡(jiǎn)單的動(dòng)作。

圖5 組織工程機(jī)器人。a. 3D打印水凝膠基質(zhì)的“生物機(jī)器人”，具有不對(duì)稱的物理設(shè)計(jì)，可由組織工程培養(yǎng)的哺乳動(dòng)物骨骼肌條驅(qū)動(dòng)。b.由一對(duì)對(duì)抗性骨骼肌組織驅(qū)動(dòng)的生物工程機(jī)器人。

 增材制造在骨骼肌組織功能化構(gòu)建上的優(yōu)勢(shì)

如圖6所示，靜電紡絲技術(shù)可制造出有序或無序的聚己內(nèi)酯微纖維束，用膠原涂覆微纖維可模擬天然肌肉，可進(jìn)一步在其表面用2%膠原-2%聚環(huán)氧乙烷(PEO)生物打印 C2C12。與無序的纖維支架相比，在膠原包被的有序纖維和有序纖維支架上可以觀察到更高的肌節(jié)組織和分化。在另一項(xiàng)關(guān)于眼內(nèi)壓的研究中，使用由明膠、纖維蛋白原、透明質(zhì)酸和甘油組成的生物墨水負(fù)載C2C12 進(jìn)行打印，可觀察到打印后 97%的細(xì)胞活力，細(xì)胞排列有序，且在分化培養(yǎng)基中 7 天后可形成肌管，將構(gòu)建物皮下植入裸鼠體內(nèi)，將解剖的腓總神經(jīng)插入構(gòu)建物中，可觀察到構(gòu)建體中的神經(jīng)整合，在肌纖維和神經(jīng)接觸上存在乙酰膽堿受體簇。此外，構(gòu)建體的血管化是通過內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)記物的表達(dá)來誘導(dǎo)的，而肌電圖顯示工程肌肉對(duì)電刺激有反應(yīng)，并且仍然是未成熟的。此外，微流控技術(shù)與生物3D 打印技術(shù)相結(jié)合，使骨骼肌組織工程可以實(shí)現(xiàn)更復(fù)雜結(jié)構(gòu)的制造。例如，利用微流控打印頭精確劃分兩種不同的光固化墨水，兩種墨水分別與 C2C12 和 BALB/3T3 成纖維細(xì)胞復(fù)合，再進(jìn)行復(fù)雜結(jié)構(gòu)打印，可實(shí)現(xiàn)兩種細(xì)胞類型區(qū)室化生長(zhǎng)，連續(xù)培養(yǎng)可形成排列整齊的多核全條紋肌管，將構(gòu)建體植入小鼠皮下，分析可獲得緊密排布的的完全成熟的全條紋肌管。

圖6 骨骼肌組織工程中的增材制造。a. 模擬骨骼肌分級(jí)組織的混合微纖維化聚己內(nèi)酯/膠原支架的制造工藝和光學(xué)/掃描電子顯微鏡圖像。b. 3D打印脫細(xì)胞支架，以促進(jìn)成肌細(xì)胞分化。c.仿生組織構(gòu)造。肌肉前體被包裹在由PCL柱支撐的水凝膠纖維內(nèi)。d.微流控精確制造含有成肌細(xì)胞和成纖維細(xì)胞的異質(zhì)性水凝膠纖維。

綜上所述，生物3D 打印技術(shù)在組織工程、再生醫(yī)學(xué)和藥物開發(fā)方面具有巨大的潛力。該技術(shù)有助于克服移植器官的短缺，為構(gòu)建健康或患病的組織模型提供了重要的工程化方法。

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